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    【SPEX 組織研磨儀】DNA提取方法的有效性和回收率比較:手動均質化與Spex Genomax?

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    內容節點
    概述
    實驗/設備條件
    樣品提取
    實驗/操作方法
    實驗結果/結論
    儀器/耗材清單

    有效地均質化生物組織和破壞細胞的能力對于產生足夠質量和數量的DNA和RNA研究所需的核酸至關重要。此外,由于其整體異質性或實驗室接收到的狀態,許多樣品需要均質化或減小顆粒大小以創建代表性樣品。均勻性是指在整個樣品中具有一致組成狀態,而異質性則在一個或多個特征上缺乏一致性。

    實驗室或分析樣品必須經過處理,以便進行提取、加工或消化以進行進一步測試。在生物樣品中,均質化可以通過破壞生物組織和溶解細胞來加速處理速度,從而允許提取遺傳物質。獲得均勻樣品的最常見方法是研磨或粉碎,這可以提高準確性并減少不確定性。在實驗室中,一些科學家使用手動或半自動的方法進行組織處理,這可能會耗費時間并且產生的樣品可能沒有完荃均質化。實施自動化的均質化和處理可以提高樣品的處理量,同時從生物材料中更快地恢復DNA/RNA。

    這項研究將證明使用自動化均質化方法在節省時間方面的效率,以及對遺傳物質的回收和提取的改進。在之前使用Spex Geno/Grinder?的研究中,發現農業和環境產品的農藥提取大大增強了回收率,同時顯著縮短了樣品制備的處理時間。

    在這項新的研究中(由Spex和HoppeSyler共同進行的聯合項目),使用手動小球攪拌器和自動化均質器(Spex Genomax)來破壞各種生物組織,然后在進行基因組DNA(gDNA)分離之前。分離的gDNA隨后用于下游敏感的應用中,以確定手動與自動均質器在分析學和分子生物學研究中的有效性。

    1 方法和材料

    該工作流程主要涉及三個過程:1. 組織均質化;2. DNA提??;3. DNA分離。

    組織均質化

    將60毫克的新鮮組織加入500微升的DNA結合緩沖液和20微升的蛋白酶K(20 mg/mL),這些試劑來自Spex DNAmax動物基因組DNA分離試劑盒。根據制造商的協議進行組織的均質化和處理。然后將樣品在55oC下以700 rpm的速度輕輕搖動15分鐘進行孵育。在蛋白酶K消化后,向裂解物中加入20微升的RNase A,并在室溫下孵育五分鐘,然后加入200微升的>95%乙醇。然后通過渦旋器將裂解物劇烈混合五秒鐘。

    DNA提取和柱清洗

    渦旋后,將700μL裂解物加載到DNAmax試劑盒提供的硅膠旋轉柱上,并在室溫下以13,000 xg離心一分鐘。丟棄流過液,并將500μL來自試劑盒的洗滌緩沖液A(添加了乙醇)添加到柱中,再次離心三分鐘。丟棄所得的流過液。

    DNA分離和洗脫

    將柱子離心額外一分鐘,并丟棄收集管。向柱子中加入100 μL的EB或TE緩沖液(pH 8.0),并在室溫下靜置三分鐘,然后再次離心一分鐘。收集含有純化的gDNA的流過液進行分析和qPCR。

    手動 VS Genomax:核酸分離和回收

    在比較手動和自動研磨的第壹次研究中,各種動物組織(牛里脊肉、雞胸肉和小鼠心臟)的樣品經過均質化、提取和分離gDNA的處理。使用手動均質化的樣品平均處理時間超過200分鐘(接近2個半小時),而使用Spex Genomax的時間不到1/2小時(圖1)。使用自動化的Genomax方法,處理時間減少了超過86%。

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    圖1. 使用手動和Genomax處理gDNA均質化、提取和分離的處理時間

    比較了三種動物組織(牛里脊肉、雞胸肉和小鼠心臟)中提取的遺傳物質的質量和數量。牛里脊肉和雞胸肉代表了不同密度的動物肌肉組織。小鼠心臟代表了難以均質化的纖維狀動物器官組織。傳統上,高密度和纖維狀組織最難均質化,并且產生的可回收gDNA量最少。使用手動方法和Genomax處理后,分離gDNA并使用紫外/可見光譜法測試濃度(圖2)。

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    圖2. 使用手動和Genomax方法在不同動物組織中回收DNA

    手動方法通常會導致DNA提取和分離不完整,而使用Genomax進行自動化均質化手動方法通常會導致DNA提取和分離不完整,而使用Genomax進行自動化均質化可以實現完荃的均質化和高效的提取,如圖3中的電泳凝膠所示。

    DNA提取方法_3.png

    圖3. 使用手動和Genomax自動化均質化處理的DNA的凝膠電泳

    在這項首冫欠研究的一項后續研究中,使用商用手動小球混合器和Spex Genomax均質器對30毫克的小鼠心臟進行均質化。根據制造商的建議,使用手動均質器對小鼠心臟進行均質化,而Genomax中的組織則經過三輪均質化處理,每輪以1500 rpm的速度均質化1分鐘,每輪之間有20秒的暫停。使用Spex DNAmax試劑盒分離DNA,并使用涵蓋小鼠Ostβ啟動子或Hic1基因體的引物制備用于qPCR分析的樣品。每個分析都進行了雙重檢測。與手動均質化相比,發現Genomax的產量增加了35倍。實際上,在使用0.25 μL至1 μL的分離gDNA時,Genomax樣品產生了強烈的曲線,而使用手動均質器分離的gDNA生成了1 μL的擴增曲線(圖4)。

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    圖4. 小鼠有機溶質轉運β啟動子的復制。9號染色體,65330248-65330323(75個堿基對) ,使用Genomax和手動處理

    使用較小體積的gDNA(0.25 μL和0.5 μL)時,目標基因的擴增在使用Genomax時被證明是成功的,而通過手動處理分離的gDNA未能產生任何信號(圖5)。

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    圖5. 低樣品體積下,使用手動方法和Genomax復制小鼠高甲基化癌癥1基因體的結果對比。染色體11,75058091-75058200(109個堿基對)

    2 結論

    自動化的均質化和細胞裂解過程提高了處理的效率,無論是在時間上還是在蕞終的gDNA提取上。使用Genomax等自動化過程,目標gDNA的質量和數量以及復制性都顯著提高,特別是與Spex DNAmax提取試劑盒結合使用時??傮w而言,使用Genomax處理樣本的時間大大減少到不到半小時,并且在較低的樣品體積下產生更多可復制的遺傳物質副本。

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