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    【CEM Liberty】全自動微波增強蛋白質全合成

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    內容節點
    概述
    實驗/設備條件
    樣品提取
    實驗/操作方法
    實驗結果/結論
    儀器/耗材清單

    摘 要

    使用微波增強的固相多肽合成(SPPS)技術和Liberty Blue? 2.0以及Liberty PRIME? 2.0可以快速高效地合成蛋白質和長肽。優化后的微波SPPS結合了一種新的頂部沖洗技術,可以實現更高純度的蛋白質序列合成。這項技術已經通過一系列生物相關蛋白質(如泛素、巴氏蛋白、胰島素原、膠原、HIV蛋白酶和MDM2)的合成得到驗證,這些蛋白質含有76-127個氨基酸,通過逐步組裝獲得良好純度,無需任何連接步驟。通過在Prodigy?制備型HPLC肽純化系統上以60°C的高溫色譜法從粗制品中分離出高純度樣品。

    引 言

    蛋白質和長肽在生物體系中扮演著至關重要的角色,并且它們是許多重要氵臺療藥物的構成要素。然而,這些生物分子的研究進展常常受到基于時間密集型表達技術和原生化學連接方法的限制。固相多肽合成(SPPS)為直接合成具有特定序列的蛋白質提供了一種途徑,并能夠迅速產生結構類似物。盡管如此,由于在合成過程中雜質的累積和產物聚集的傾向,長肽和蛋白質的SPPS合成面臨著不小的挑戰。在早期,SPPS主要被應用于生產較短的片段,以便進行原生化學連接,而對于較長序列的合成能力相對受限[1]。近來,快速流動式合成方法展示了其以極短周期時間組裝長序列的顯著潛力。但這種方法的一個缺點是,它需要使用大量的氨基酸(通常是≥ 100當量),并且伴隨著大量廢物的產生。


    微波加熱技術現在已經被普遍應用于多肽合成,并且已經證實其能夠有效地克服肽鏈聚集的難題,并促進困難反應的順利進行[3,4]。通過結合優化的碳二亞胺耦合條件和微波加熱(CarboMAX? 技術),可以實現最小程度的差向異構化,并且與傳統使用鏻鹽和強堿的更為激烈激活方法相比,能夠實現更高純度的合成效果。此外,采用無需中間排放步驟的一鍋法耦合和脫保護流程,使得整個過程更加迅速和高效。


    在2022年,推出了新一代的微波肽合成器系列——Liberty PRIME 2.0和Liberty Blue 2.0。這些先進設備采用了創新的頂部沖洗技術,該技術在肽合成過程中能夠保持反應容器表面的清潔度。通過預防揮發性試劑的再冷凝,頂部沖洗技術有效避免了對后續反應的污染。隨著長蛋白質合成的進行,每個反應步驟中即使是微小的純度提升也會累積起來,蕞終轉化為整體純度的顯著提高。利用Liberty PRIME 2.0,成功合成了一系列具有挑戰性的蛋白質,包括76個氨基酸的泛素、86個氨基酸的胰島素原、89個氨基酸的巴氏蛋白、99個氨基酸的類膠原蛋白序列和HIV蛋白酶,以及127個氨基酸的MDM2。


    Liberty Blue 2.0.png

    圖1. Liberty PRIME 2.0

    蛋白質合成流程經過精心優化,僅需要10到20當量的氨基酸,平均每個合成周期只需大約7.5分鐘,這樣的高效率使得目標蛋白可以在一晚上的時間內(每輪運行10至17小時)以較高的初始純度完成合成。到了第二天,所合成的蛋白質便被分離并轉移到Prodigy純化系統,在那里它們通過60°C的升溫色譜法得到進一步凈化。這一?程不僅速度迅捷,而且試劑的使用也木及具效率(詳見表1)。

    材料與方法

    試 劑

    從CEM Corporation(Matthews, NC)獲得的以下Fmoc氨基酸包含所示的側鏈保護基團:Ala, Asn(Trt), Arg(Pbf), Asp(OMpe), Asp(OtBu)-(Dmb)Gly, Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Gly, His(Boc), Ile, Leu, Lys(Boc), Phe, Pro, Met, Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), 和 Val。Rink Amide ProTide? LL樹脂(0.20 meq/g替代)也來自CEM Corporation。N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)、吡咯烷、三氟乙酉夋(TFA)、3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇(DODT)和三異丙基硅烷(TIS)來自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水乙酉迷(Et2O)和乙酸來自VWR(West Chester, PA)。LC-MS級水(H2O)和LC-MS級乙腈(MeCN)來自Fisher Scientific(Waltham, MA)。

    蛋白質合成

    蛋白質合成在CEM Liberty PRIME 2.0自動化微波肽合成儀上進行,采用Rink Amide ProTide? LL樹脂,合成規模為0.05或0.1毫摩爾。脫保護步驟使用DMF中的吡咯烷進行處理。偶聯反應則通過使用10或20當量的Fmoc保護氨基酸與DIC和Oxyma Pure在DMF中反應(遵循改良的CarboMAX方案)。蛋白質的切割在室溫或38°C下進行,使用的是TFA/H2O/TIS/DODT混合物。切割完成后,蛋白質通過乙酉迷沉淀并經過夜凍干處理以獲得蕞終產品。

    蛋白質純化

    蛋白質通過裝備有Intrepid C18, 21.2 mm x 250 mm, 5 μm色譜柱的Prodigy系統上的高溫HPLC進行純化。粗蛋白首先溶解在水中并過濾后注射進樣。分離在40或60°C下進行,使用含有0.1% TFA的(i)水和(ii)乙腈的梯度洗脫。

    蛋白質分析

    蛋白質在裝備有Q Exactive plus MS的ThermoFisher UPLC系統上進行分析,使用Acquity UPLC BEH C8色譜柱(1.7 mm x 100 mm)。峰分析在Chromeleon軟件上完成。分離使用含有0.05% TFA的(i)水和(ii)乙腈的梯度洗脫進行。

    成 果

    表1. 每種蛋白質的合成時間和產生的廢液總量

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    表2. 每個蛋白質的氨基酸序列

    加粗的DG表示使用了Asp(OtBu)-(DMB)Gly

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    結 論

    微波固相肽合成(Microwave SPPS)技術已證明是一種用于合成大型肽鏈和蛋白質的強大且高效的方法。在Liberty PRIME 2.0設備上進行的實驗展示了其能力,成功合成了六種不同長度(從76至127個氨基酸)的蛋白質。這一自動化過程僅需10至17小時即可完成單個蛋白質的合成,并且目標蛋白質能夠通過Prodigy系統的高溫制備型HPLC迅速純化出來。與天然化學連接或蛋白質表達的傳統方法相比,這種快速且方便的替代方案提供了顯著的效率優勢。此外,Liberty PRIME 2.0和Liberty Blue 2.0系統具有高度適應性,可用于引入非天然氨基酸或制備特殊蛋白質。整個組裝過程不僅速度快、效率高,而且產生的廢物極少,顯示出其優越的環保性能。


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    圖1.泛素樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的UPLC-MS 分析

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    圖2.原胰島素粗樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析

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    圖3.芽孢桿菌RNA酶樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析

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    圖4.艾滋病毒蛋白酶樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析

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    圖5.膠原蛋白樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析

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    圖6.MDM2樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析


    參考文獻

    [1] Hou, W.; Zhang, X.; Liu, C.-F., Progress in Chemical Synthesis of Peptides and Proteins. Transactions of Tianjin University 2017, 23 (5), 401-419.

    [2] Hartrampf, N.; Saebi, A.; Poskus, M.; Gates, Z. P.; Callahan, A. J.; Cowfer, A. E.; Hanna, S.; Antilla, S.; Schissel, C. K.; Quartararo, A. J.; Ye, X.; Mijalis, A. J.; Simon, M. D.; Loas, A.; Liu, S.; Jessen, C.; Nielsen, T. E.; Pentelute, B. L., Synthesis of proteins by automated flow chemistry. Science 2020, 368(6494), 980-987.

    [3] Bacsa, B.; Horváti, K.; B?sze, S.; Andreae, F.; Kappe, C.O., Solid-Phase Synthesis of Difficult Peptide Sequences at Elevated Temperatures: A Critical Comparison of Microwave and Conventional Heating Technologies. J. Org. Chem. 2008, 73 (19), 7532-7542.

    [4] Friligou, I.; Papadimitriou, E.; Gatos, D.; Matsoukas, J.;Tselios, T., Microwave-assisted solid-phase peptide synthesis of the 60–110 domain of human pleiotrophin on 2-chlorotrityl resin. J. Amino Acids 2011, 40 (5), 1431-1440.

    [5] CEM: CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperatures. CEM Corporation Website, Application Notes.[Online]. Published Online: January 9, 2018.

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