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    干貨分享!實時熒光 PCR 檢測技術在沙門菌血清鑒定中的應用

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    內容節點
    概述
    實驗/設備條件
    樣品提取
    實驗/操作方法
    實驗結果/結論
    儀器/耗材清單

    沙門氏菌是一種較常見的食源性腸道致病菌,是腸桿菌科中最復雜的菌屬,其抗原結構主要由菌體抗原( O 抗原) 、鞭毛抗原( H 抗原) 及表面抗原( Vi 抗原等) 3 部分組成。根據各抗原組成的不同,可將沙門菌分為不同的血清型,目前已確認的有2 600多種血清型,我國已檢出 300 余種。


    由不同血清型沙門氏菌引發的疾病類型會有所差異,沙門氏菌血清型的準確快速鑒定對暴發流行中的溯源分析具有重要意義。實時熒光 PCR 法和傳統的玻片凝集法是沙門氏菌血清分型的兩種不同檢測方法,本研究對比兩種方法在實驗操作、檢測成本及靈敏度等方面的差異,了解實時熒光 PCR檢測技術在沙門氏菌血清分型中的實際應用價值。


    菌株來源

    144 株沙門菌分離來自不同樣本。


    比對方法

    玻片凝集法,和實時熒光PCR法(美正生物沙門菌血清型分子鑒定試劑盒)


    01方法介紹


    玻片凝集法


    將 144 株待檢測的沙門氏菌株分別接種于血瓊脂平板,37℃ 培養箱中培養 18 ~ 24 h后,進行玻片血清凝集反應。先做 O 多價血清,再做O 單價血清,確定 O 群后再做 H 多價及 H 單價血清。將 O、H 相凝結果與 Kaufmann-White 沙門氏菌抗原表對照,檢索出血清型。


    實時熒光PCR法


    北京美正生物科技有限公司的沙門氏菌血清型分子鑒定試劑盒是根據沙門氏菌種編碼抗原基因特異性進行高通量篩選,最終篩選出 12 個沙門菌基因,并以此建立沙門氏菌血清型數據庫,此數據庫目前包含 128種常見沙門氏菌血清型。采用實時熒光 PCR 技術檢測待測菌株目的基因,記錄樣品不同預混液( MSS01-MSS12) 對應通道的 Ct 值,并將其轉化為單重斷定式,輸入試劑盒配套的沙門血清鑒定表,得到血清型鑒定結果。


    02統計分析


    采用 SPSS 22. 0 軟件進行統計分析,以玻片凝集法鑒定結果為金標準,對實時熒光 PCR 法進行效果評價,統計指標包括靈敏度、特異度、約登指數,并將兩種方法檢測結果進行 Kappa 一致性檢驗,若 Kappa 值>0. 5,則說明一致性較好。以 P<0. 05 為差異有統計學意義。


    03結果分析

    表1.png


    實時熒光 PCR 法檢測結果中,與玻片凝集法的鑒定結果完全一致 134株,且 4 種優勢血清型( 德爾卑沙門菌、鼠傷寒沙門菌、姆班達卡沙門菌和里森沙門菌) 結果完全一致; 與玻片凝集法不一致菌株 10 株,分別為倫敦沙門菌、嬰兒沙門菌、紐波特沙門菌、西安普頓沙門菌、恩戈爾沙門菌、阿伯丁沙門菌、羅森沙門菌、伊麗莎白維爾沙門菌、羅米他沙門菌各 1 株??赡芘c致病菌自身部分待測基因環境或宿主的改變發生突變,進而基因組呈現多樣性有關。4 種沙門菌優勢血清型兩種方法分型結果完全一致,且此血清型分布與 2017年無錫市食品行業從業人員沙門菌血清分布基本一致。


    04總結討論


    玻片凝集法直觀且可靠性高,是目前公認的沙門菌血清分型金標準。但耗時長,操作過程復雜,需嘗試的血清診斷試劑較多,鑒定成本高,常要受制于試劑種類與質量優劣,且需多次誘導時具有一定鑒定難度。部分粗糙型自凝性沙門菌利用玻片凝集法不能進行分型。個別情況下沙門菌的抗原與血清凝集反應程度較弱,對實驗人員經驗和操作水平要求高。


    實時熒光 PCR 法是基于目標基因簇中特定區域或基因片段,操作簡單,不易出現差錯,對普通實驗人員來說從分離培養、提取核酸到檢測、記錄 Ct 值、確定血清分型最多僅需要 1 d,且常規的一塊 96 孔 PCR 板可以同時檢測 8 份樣本,極大縮短了檢測時間。但實時熒光 PCR 法對一些不常見、存在交叉情況的血清型鑒定時,尚無法準確判斷沙門菌血清型。


    采用實時熒光 PCR 檢測技術效果良好,尤其當檢測量較大時,檢測效率較高; 對較不常見或血清型存在交叉的菌株,在實時熒光 PCR 法的基礎上,再有針對性地進行凝集試驗,可省去逐一用血清試劑做凝集反應的繁瑣步驟。


    (文章來源:王雅靜,管紅霞,沙丹等.實時熒光PCR檢測技術在沙門菌血清鑒定中的應用[J].江蘇預防醫學,2023,34(01):105-107.)


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    表2.png

    表3.png





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